Florey è nato ad Adelaide, nell'Australia meridionale, figlio del preside di una scuola. Frequentò il St Peter's College di Adelaide e l'Università di Adelaide, dove si laureò in scienze nel 1921 e in medicina nel 1924.
Dopo aver completato la sua laurea in medicina, Florey ha lavorato presso il Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research di Melbourne, dove ha incontrato Ernst Chain. Nel 1928 si trasferirono alla Sir William Dunn School of Pathology dell'Università di Oxford, dove iniziarono a lavorare allo sviluppo della penicillina.
La penicillina era stata scoperta nel 1928 da Alexander Fleming, ma non era stata trasformata in un farmaco utilizzabile. Florey e Chain riuscirono a isolare il principio attivo della penicillina e a purificarlo in modo che potesse essere iniettato nei pazienti. Svilupparono anche metodi per la produzione di massa della penicillina, che ne permisero un ampio utilizzo durante la seconda guerra mondiale.
Il lavoro di Florey e Chain sulla penicillina salvò innumerevoli vite durante la seconda guerra mondiale e rivoluzionò il trattamento delle malattie infettive. Florey ricevette il Premio Nobel per la Fisiologia e la Medicina nel 1945 e fu nominato cavaliere nel 1944.
Florey fu anche un illustre amministratore ed educatore. Ha servito come vicerettore dell'Università di Oxford dal 1959 al 1962 ed è stato presidente della Royal Society di Londra dal 1960 al 1965. È stato anche membro dell'Australian Academy of Science e dell'American Academy of Arts and Sciences. e l'Accademia Nazionale delle Scienze.
Florey morì di ictus a Oxford nel 1968. È considerato uno dei più importanti scienziati australiani del 20° secolo e il suo lavoro sulla penicillina ha salvato milioni di vite.