L'amore non corrisposto è un tema ricorrente nella commedia, poiché diversi personaggi sono innamorati di qualcuno che non ricambia il loro affetto. Viola, ad esempio, è innamorata del duca Orsino, a sua volta innamorato di Olivia. Olivia, a sua volta, è innamorata di Cesario (che in realtà è Viola sotto mentite spoglie). Ciò crea una complessa rete di amore non corrisposto che guida gran parte dell'azione e dell'umorismo dell'opera.
Anche l'identità sbagliata è una caratteristica chiave dell'opera. Viola si traveste da uomo di nome Cesario per entrare al servizio di Orsino. Questo travestimento porta a una serie di incomprensioni e complicazioni, poiché altri personaggi scambiano Viola per un uomo e si innamorano di lei. L'identità sbagliata crea anche opportunità per Viola di osservare e commentare gli altri personaggi, aggiungendo umorismo alla commedia.
Nel complesso, l'amore non corrisposto e l'identità sbagliata sono due caratteristiche chiave che contribuiscono all'umorismo e alla complessità di La dodicesima notte.