È nato Robert John Wagner, Jr. a Cincinnati, Ohio. I suoi genitori erano Robert John Wagner, Sr., un venditore ambulante per un'azienda farmaceutica, e Helen (nata Hohman) Wagner, che era impiegata in una panetteria. Aveva una sorella minore, Mary Wagner, e un fratello minore, William John Wagner.
La famiglia di Wagner si trasferì a Los Angeles quando Bob aveva 12 anni. Cominciò a recitare all'età di 16 anni, quando fu scoperto da un talent scout mentre si esibiva in una recita scolastica. Ha firmato con la William Morris Agency e ha iniziato ad apparire in piccoli ruoli in film e programmi televisivi.
La grande occasione per Wagner arrivò nel 1951 quando gli fu assegnato il ruolo principale nel film "Con una canzone nel cuore". Ha continuato a recitare in numerosi film di successo, tra cui "Stars and Stripes Forever" (1952), "The Band Wagon" (1953), "The Eddie Cantor Story" (1953) e "Deep in My Heart" ( 1954).
La carriera televisiva di Wagner iniziò all'inizio degli anni '50, quando apparve in episodi di spettacoli come "Lux Video Theatre" e "The Colgate Comedy Hour". Aveva la sua serie televisiva, "It's Always Jan" (1955-1956), e ha anche recitato nelle sitcom "The Bob Wagner Show" (1957-1958) e "The Robert Wagner Show" (1958-1959).
Negli anni '60 Wagner continuò ad apparire in film e programmi televisivi. Ha recitato in film come "Affonda la Bismarck!" (1960), "Il giorno più lungo" (1962), "La grande corsa" (1965) e "Harper" (1966). Ha avuto anche un ruolo ricorrente nella serie televisiva "The Saint" (1962-1969).
Negli anni '70 la carriera di Wagner iniziò a declinare. È apparso in meno film e programmi televisivi e spesso ha dovuto assumere ruoli secondari. Tuttavia, ha recitato nelle miniserie di successo "Masada" (1981) e "I peccati del padre" (1984).
Negli anni '80 la carriera di Wagner riprese. Ha recitato nelle serie televisive di successo "Hart to Hart" (1979-1984) e "Scarecrow and Mrs. King" (1983-1987). È apparso anche in numerosi film di successo, tra cui "Ice Station Zebra" (1968), "The Towering Inferno" (1974) e "The Pink Panther Strikes Again" (1976).
Negli anni '90 Wagner ha continuato ad apparire in film e programmi televisivi. Ha recitato in film come "Dragonfly" (2002) e "Austin Powers in Goldmember" (2002). Ha avuto anche un ruolo ricorrente nella serie televisiva "Monk" (2002-2009).
L'ultima interpretazione cinematografica di Wagner è stata nel film del 2008 "The Second Chance". Morì di polmonite il 18 marzo 2008.
Wagner è stato sposato tre volte. È stato sposato per la prima volta con l'attrice Natalie Wood dal 1957 al 1962. Hanno avuto una figlia insieme, Natasha Gregson Wagner. È stato poi sposato con l'attrice Marion Marshall dal 1963 al 1970. Hanno avuto due figli insieme, Katie Wagner e Joshua Wagner. Alla fine è stato sposato con l'attrice Jill St. John dal 1990 fino alla sua morte nel 2008.
Wagner è stato un attore di successo con una carriera durata oltre sessant'anni. Ha recitato in oltre 100 film e programmi televisivi ed era una figura amata a Hollywood.